Цель. Сравнить антимикробную активность шести различных растворов (коктейля антибиотиков, хлоргексидина в двух концентрациях (0,05 и 0,2%), глицерина, смеси глицерина и этанола, а также коммерческого раствора «Оптифен») и оценить влияние данных растворов на механические свойства (прочность на разрыв и модуль Юнга) сосудистой стенки на протяжении 50 сут. хранения.

Методы. Фрагменты аорт свиней хранили в исследуемых растворах на протяжении 50 сут. Микробиологический анализ образцов проводили через каждые 10 сут. Разрывные испытания для исследования механических свойств образцов проводили на 10, 30 и 50-е сут. при помощи разрывной машины ESM301 (MARK-10, США).

Результаты. Микробиологический анализ показал, что образцы, которые хранили в растворе «Оптифен» и хлоргексидине 0,2%, были стерильны на протяжении всего срока эксперимента. При хранении в коктейле антибиотиков образцы оставались стерильными на протяжении 40 дней. Раствор хлоргексидина 0,05% и глицерин не обладали необходимыми биоцидными свойствами. На биомеханические свойства в наименьшей степени оказывает влияние хранение в растворе «Оптифен», а наибольшее — в хлоргексидине 0,2%

Заключение. На основании данных микробиологического анализа и исследования биомеханических свойств можно сделать вывод, что наиболее предпочтительной средой для длительного влажного хранения сосудов является препарат «Оптифен». Однако для окончательного выбора оптимальной среды хранения необходимы данные тщательного морфологического анализа образцов сосудистой стенки на различных сроках хранения в исследуемых растворах, а также после подкожной имплантации экспериментальным животным.

Введение
Реконструктивная хирургия при патологии восходящего отдела аорты является одной из серьезных проблем сердечно-сосудистой хирургии. Одним из широко используемых методов хирургического лечения данной патологии является протезирование восходящего отдела аорты и аортального клапана клапаносодержащим кондуитом [1–3]. «Золотым стандартом» протезов для замены поврежденных элементов сердечно-сосудистой системы является аллогенный трупный материал, поскольку он обладает превосходными гемодинамическими свойствами, устойчив к инфекции, обладает низкой тромбогенностью [4], а также при его использовании наблюдается самый высокий уровень свободы от реопераций по поводу структурной дезорганизации ткани [1].
От момента изготовления до имплантации пациенту аллографт либо подвергают криоконсервации, либо хранят в коктейле антибиотиков и противогрибковых препаратов, воздействующих на максимально возможный спектр патогенов. Однако, как показывает практический опыт (в том числе лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии ФГБУ «НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России), оба метода имеют недостатки. При нарушении сложной и многоступенчатой методики криоконсервации возможно появление микрокристаллов льда в стенке аллографта, что приводит к раннему разрушению соединительнотканного каркаса и кальцификации протеза после имплантации [5, 6]. Показано, что использование свежеизготовленных графтов, которые не подвергали криоконсервации, а хранили в коктейле антибиотиков, снижает частоту реопераций, связанных с кальцификацией и разрушением протеза [7]. Однако влажное хранение аллографтов в коктейле антибиотиков возможно в течение ограниченного периода времени (не более двух недель) [8], после чего аллографт рекомендуется подвергнуть криоконсервации для более длительного хранения. Также известно, что остаточное количество антибиотиков в ткани аллографта является частой причиной аллергических реакций [9].

Таким образом, необходим поиск биоцидной среды для влажного хранения аллографтов, которая предотвращает рост большинства типичных для человека патогенов и сохраняет механические прочностные свойства обработанной ткани близкими к нативному состоянию в течение длительного времени. Стоит отметить, что как повышение, так и понижение прочности сосудистой стенки в процессе хранения может привести к неблагоприятным последствиям после имплантации, таким как разрушение графта и нарушение гемодинамики, что повышает вероятность повторной операции по замене графта. Кроме того, идеальная среда хранения должна полностью удаляться из протеза путем промывания в физиологическом растворе непосредственно перед операцией (в течение 30 мин), и остаточное количество среды не должно оказывать токсического влияния на организм реципиента.
При поиске и разработке оптимальной среды для влажного хранения исследователи сталкиваются с технической трудностью: для экспериментальной работы по подбору оптимального состава биоцидной среды требуется большое количество аллогенного материала, что по понятным причинам невозможно (помимо этических моментов существуют строгие критерии отбора посмертных доноров для изъятия аллографтов) [10]. Представленное в данной статье экспериментальное исследование по подбору оптимальной биоцидной среды проведено на ксеноматериале (фрагменты аорт свиней). Сравнили антимикробную активность шести различных растворов: коктейля из антибиотиков, хлоргексидина (ХГ) в двух концентрациях (0,05% и 0,2%), глицерина, смеси глицерина и этанола, коммерческого раствора «Оптифен», — а также оценили влияние данных растворов на механические свойства (прочность на разрыв и модуль Юнга) ксеногенных тканей сосудов на протяжении 50 сут. хранения.

Методы
Экспериментальный материал
В качестве экспериментального материала использовали выходной фрагмент аорты свиней. Материал забирали максимально возможным чистым способом в цехе убоя скота мясокомбината. Очищенные от свободно прилегающих тканей (адвентиции и жировой ткани) и отсеченные от корня фрагменты аорты помещали в охлажденный стерильный физиологический раствор для последующей транспортировки в лабораторию. Количество необходимого ксеноматериала определяли по следующему расчету: из одной аорты возможна заготовка 4 образцов на поперечные и 4 образцов на продольные прочностные испытания.
Дальнейшие манипуляции с сосудами проводили в стерильном боксе лаборатории экспериментальной хирургии и морфологии ФГБУ «НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России. Аорты разрезаны на фрагменты 70×20 мм без видимых повреждений и естественных отверстий.
Образцы исходного поступившего материала (натив) направлены в микробиологическую лабораторию для определения начальной бактериально-грибковой обсемененности, а также исследованы их биомеханические свойства на разрывной машине ESM301 (MARK-10, США). Остальные фрагменты случайным образом распределены по исследуемым растворам и хранились в течение 50 сут. Общая схема эксперимента представлена на рис. 1.

Исследуемые растворы
Фрагменты аорты случайным образом распределены на 6 групп, каждая из которых помещена в один из растворов:
I — коктейль антибиотиков (АБ): культуральная среда RPMI-1640 (BioloT, Россия), метронидазол 0,27 мг/мл, гентамицин 0,53 мг/мл, цефазолин 6,66 мг/мл, ампициллин 2,22 мг/мл, оксациллин 1,11 мг/мл, флуконазол 0,027 мг/мл. Через 48 ч произведена замена раствора на свежий с такими же концентрациями антибиотиков;
II — «Оптифен»: смесь 1,2-октандиола, феноксиэтанола, сорбиновой кислоты (1%) и этанола (20%) (патент RU 2580621C1 [11]);
III, IV — хлоргексидин 0,05% или 0,2%: раствор ХГ в дистиллированной воде с концентрацией 0,05 или 0,2%;
V — глицерин: глицерин (20%) в культуральной среде RPMI-1640 (BioloT, Россия);
VI — этанол-глицерин: этанол (10%) и глицерин (20%) в культуральной среде RPMI-1640 (BioloT, Россия).
Во всех исследуемых растворах фрагменты аорты хранились в течение 50 сут.

Микробиологический анализ
Контроль бактериальной чистоты осуществляли из посева в каждый срок (10, 20, 30, 40 и 50 сут.) по 2 образца ткани из каждой группы (рис. 1). Для этого образцы тканей отрезали от основного фрагмента материала, помещали в стерильную пробирку, маркировали и передавали в бактериологическую лабораторию ФГБУ «НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России.

Исследование биомеханических свойств
Испытания прочности проводили для 10 образцов из каждой группы на 10, 30 и 50-е сут. (рис. 1). Использовали разрывную машину ESM301 (MARK-10, США). Скорость растяжения ткани 30 мм/мин. Растяжение образцов проводили отдельно в продольном и поперечном направлениях относительно оси сосуда. Образцы высекали из заготовок вырубной матрицей. Толщину образца троекратно замеряли при помощи электронного цифрового толщиномера: ширина и длина образца соответствовала размерам матрицы (10 и 28,5 мм соответственно). Если разрыв происходил по месту закрепления образцов в зажимах, данные этого измерения не учитывали в анализе. Прочность на разрыв (Н/мм2) определяли как отношение значения максимальной силы (Н) к площади поперечного сечения (мм2) фрагмента аорты.

Модуль Юнга определяли по следующей формуле:
Е = F × l / S × Δl,
где Е — Модуль Юнга (МПа), F — максимальная сила (Н), l — длина матрицы (мм), S — площадь поперечного сечения образца (м2), Δl — максимальное изменение длины фрагмента (мм) до разрыва образца.
Статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили c использованием однофакторного дисперсионного анализа ANOVA и апостериорного сравнения по критериям подлинной значимости LSD (пакет Statistica 8, StatSoft Inc., США). Порог статистической значимости установлен на уровне p<0,05.

Результаты
Микробиологический анализ
В исходных фрагментах аорты свиней (нативе) микробиологический анализ обнаружил:
1. грамположительные кокки: Staphylococcus saprophyticus, Enterococcus feacalis, Enterococcus spp., Staphylococcus spp.;
2. грамотрицательные палочки: Escherichia coli, Citrobacter freundii, Klebsiella pneumoniae, Salmonella spp., Aeromonas hydro.
После хранения в растворе «Оптифен», ХГ 0,2% и этаноле-глицерине фрагменты аорты стерильны на протяжении всего срока наблюдения. При хранении в растворе АБ образцы остаются стерильными на протяжении 40 дней, на 50-й день хранения по микробиологическому анализу обнаружили Candida non albicans (грибы) и Bacillus spp. (грамположительная палочка). Раствор ХГ 0,05% и глицерин не обладают необходимыми дезинфицирующими свойствами, поскольку на 10-й день хранения по микробиологическому анализу обнаружили Citrobacter freundii (грамотрицательная палочка) в образцах, хранящихся в растворе ХГ 0,05%, и Pseudomonas aeruginosa (грамотрицательная палочка) в образцах, хранящихся в глицерине. Эти два раствора исключены из дальнейшего анализа.
Стоит отметить, что начиная с 20–30-х сут. наблюдения происходило помутнение раствора АБ, в растворе ХГ 0,2% после 10-х сут. хранения появилась светлая мелкая хлопьевидная взвесь. «Оптифен», а также смесь, содержащая спирт и глицерин, оставались прозрачными на протяжении всего времени эксперимента.

Биомеханические свойства
Прочность поперечных срезов аорты свиней (рис. 2, А) при хранении во всех растворах статистически значимо увеличивается к 50-м сут. по сравнению с исходными необработанными фрагментами аорты (нативом). При этом в группах раствора «Оптифен» и этанола-глицерина прочность увеличивается на 26%, а в группах АБ и ХГ на 39 и 41% соответственно. Стоит отметить, что во всех растворах, кроме препарата «Оптифен», увеличение прочности наблюдается уже на 30-е сут. и продолжает увеличиваться к 50-м сут. При хранении в ХГ 0,2% увеличение прочности на 10-е сут. почти достигает статистической значимости (р = 0,0515).

Прочность продольных срезов аорты не изменяется при хранении в растворе «Оптифен» и этаноле-глицерине (рис. 2, B). Однако она статистически значимо увеличивается на 35% на 50-е сут. при хранении в растворе АБ, а при хранении в ХГ 0,2% статистически значимо повышается на 24% уже на 30-е сут. (на 36% на 50-е сут.).
Модуль Юнга (модуль упругости) для поперечных срезов аорты (рис. 2, C) при хранении в АБ статистически значимо увеличивается на 50-е сут. (на 28%), при хранении в этаноле-глицерине — на 30-е сут. (на 33%), а при хранении в ХГ 0,2% — на 10-е сут. (на 37%). Хранение фрагментов аорты в растворе «Оптифен» не приводит к изменению модуля Юнга по сравнению с нативными образцами на протяжении всего эксперимента.
Для продольных срезов аорты (рис. 2, D) наблюдается большой разброс значений модуля Юнга. Статистической значимости достигает только увеличение модуля упругости при хранении в ХГ 0,2% в течение 30 сут. (на 16%).
Биомеханические параметры для продольных и поперечных фрагментов аорты не изменяются при хранении в глицерине в течение 10 сут. В растворе ХГ 0,05% прочность и модуль Юнга для поперечных фрагментов увеличивается по сравнению с нативными фрагментами на 10-е сут. хранения на 44 и 32% соответственно. Однако поскольку для этих растворов получены неудовлетворительные результаты микробиологического анализа, исследование биомеханических свойств на более поздних сроках для них не проводили.

Абсолютные значения прочности и модуля Юнга для поперечных и продольных срезов аорты свиней при хранении в исследуемых растворах представлены в таблице.

Обсуждение
Тщательная антимикробная обработка тканей и органов, полученных от посмертных доноров, чрезвычайно важна при изготовлении аллографтов для сердечно-сосудистой хирургии [12]; при этом такая обработка не должна изменять или повреждать структуру ткани. С целью наилучшего сохранения структуры и свойств сосудистых аллографтов при влажном хранении ранее проводили исследования различных соединений с антимикробной активностью, таких как этанол, перуксусная кислота, метиленовый синий, гипохлорит натрия [10, 13–16]. Однако время влажного хранения в этих исследованиях составляло от нескольких дней до двух недель. Существует необходимость в увеличении периода влажного хранения до нескольких месяцев с целью увеличения доступности донорских тканей в течение более длительного периода времени без криоконсервации. В представленной работе аорты свиней хранили в различных растворах в течение 50 сут. При этом каждые 10 сут. забирали образцы для микробиологического анализа, а исследование биомеханических свойств проводили на 10, 30 и 50-е сут.
В качестве контрольной биоцидной среды использован коктейль из антибиотиков и противогрибковых препаратов (метронидазол, гентамицин, цефазолин, ампициллин, оксациллин и флуконазол). Стоит отметить, что различные банки тканей используют разные составы таких коктейлей [17–21], при этом зачастую отличается не только состав антибиотиков, но также их концентрация и условия хранения (при комнатной температуре или в холодильнике) [12, 15]. Мы использовали коктейль антибиотиков, который традиционно применяется для обработки донорских тканей в ФГБУ «НМИЦ им. ак. Е.Н. Мешалкина» Минздрава России и хорошо зарекомендовал себя при кратковременном влажном хранении аллографтов. Согласно результатам, данный коктейль антибиотиков эффективно стерилизует фрагменты аорты на протяжении 40 сут., однако при более длительном хранении антимикробная эффективность снижается. Кроме того, при длительном влажном хранении происходит увеличение прочности (в поперечном направлении уже на 30-е сут., а в продольном — на 50-е сут. хранения) и модуля Юнга (в поперечном направлении на 50-е сут. хранения), что свидетельствует о негативном влиянии данной среды хранения на структуру сосудистой стенки.

«Оптифен» — это запатентованная биоцидная композиция для асептического хранения консервированного протезного материала из тканей животного происхождения (патент RU 2580621C1). Антимикробный агент представляет собой смесь двухатомного спирта жирного ряда, феноксиэтанола и сорбиновой кислоты. По результатам исследования, данный препарат эффективно дезинфицирует сосуды на протяжении всего срока наблюдения, а также в наименьшей степени, по сравнению с другими исследуемыми растворами, влияет на биомеханические свойства, увеличивая только прочность в поперечном направлении к 50-м сут. наблюдения.
Хлоргексидин — доступный монокомпонентный препарат, в достаточно низких концентрациях обладающий бактерицидными свойствами для широкого спектра патогенов [22, 23]. При хранении в растворе ХГ с концентрацией 0,2% образцы были стерильны на протяжении всего эксперимента, однако наблюдается увеличение прочности и модуля Юнга как в продольном, так и поперечном направлении на 30-е сут. (а в случае модуля Юнга для поперечных срезов — уже на 10-е), что свидетельствует о значительном влиянии данного препарата на структуру сосудистой стенки. При снижении концентрации ХГ до 0,05% наблюдается бактериальная обсемененность образцов на 10-е сут. эксперимента, что свидетельствует о недостаточной бактерицидной эффективности данной концентрации. При этом прочность на разрыв и модуль Юнга в поперечном направлении увеличились по сравнению с нативом. В связи с этим данная концентрация ХГ исключена из дальнейшего анализа. Влияние хлоргексидина на биомеханические свойства сосудистой стенки можно объяснить тем, что в его состав входят положительно заряженные гуанидиновые группы, которые могут связываться с отрицательно заряженными аминокислотами (например, глутаминовой кислотой), входящими в состав коллагеновых волокон. Вследствие такого взаимодействия может изменяться конформация структурных белков, что, по-видимому, приводит к увеличению прочностных свойств стенки сосуда.
Высокие концентрации глицерина (85–98%) традиционно используют для консервации и обеззараживания кожных лоскутов [24, 25]. Данные пилотного эксперимента, проведенного в нашей лаборатории, показали, что глицерин в концентрациях 40 и 80% приводит к излишнему упрочнению сосудистой стенки, в то время как концентрация 20% не влияет на биомеханические свойства (неопубликованные данные). В представленной работе мы выявили, что глицерин в концентрации 20% не обладает достаточной бактерицидной эффективностью, поскольку на 10-е сут. эксперимента наблюдалась бактериальная обсемененность образцов аорты. В следствие чего глицерин исключен из дальнейшего анализа.
Мы предположили, что добавление этанола (10%) к глицерину (20%) улучшит бактерицидные свойства смеси. Результаты подтвердили эту гипотезу, поскольку образцы аорты были стерильны при хранении в данной смеси на протяжении всего эксперимента. Кроме того, ранее показано, что этанол способствует девитализации сосудистой стенки, что в дальнейшем должно снизить иммунный ответ реципиента на чужеродную ткань [13]. Однако в ходе анализа изменения биомеханических свойств выявили негативное влияние длительного хранения фрагментов аорты в данной смеси, поскольку увеличиваются прочность и модуль Юнга в поперечном направлении через 30 и 50 сут.

Заключение
На основании данных микробиологического анализа и исследования биомеханических свойств можно сделать вывод, что предпочтительной средой для длительного влажного хранения сосудов является препарат «Оптифен», поскольку он обладает выраженной антимикробной эффективностью и в наименьшей степени влияет на структуру сосудистой стенки. Однако для окончательного выбора оптимальной среды хранения необходимы данные тщательного морфологического анализа образцов сосудистой стенки на различных сроках хранения в исследуемых растворах, а также после подкожной имплантации экспериментальным животным, что является целью дальнейшего исследования.

Финансирование
Исследование не имело спонсорской поддержки.

Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов
Концепция и дизайн работы: М.Б. Васильева, Д.С. Сергеевичев
Проведение эксперимента, сбор данных: М.Б. Васильева, Е.В. Кузнецова, Я.Л. Русакова, Е.В. Чепелева, А.А. Докучаева
Микробиологический анализ: М.В. Лунина, Л.М. Самойлова
Анализ и статистическая обработка данных: А.А. Красильникова, М.Б. Васильева
Написание статьи: А.А. Красильникова
Редактирование статьи: М.Б. Васильева, Д.С. Сергеевичев
Утверждение окончательного варианта статьи: М.Б. Васильева, А.А. Красильникова, Е.В. Кузнецова, М.В. Лунина, Л.М. Самойлова, Я.Л. Русакова, Е.С. Чепелева, А.А. Докучаева, Д.С. Сергеевичев